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      一、服務概述
              Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic RepeatsCRISPR)是細菌和古細菌為應對病毒和質粒不斷攻擊而演化來的獲得性免疫防御機制,其中IICRISPR/Cas免疫系統依賴Cas9內切酶家族能夠靶向和剪切外源DNA,是目前使用最廣泛的CRISPR/Cas9系統。
              相對ZNF&TALEN編輯技術,作為第三代基因編輯技術——CRISPR/Cas9系統具有顯著優勢。首先,載體構建簡單且靶向效率高,只需要構建20堿基的CRISPR gRNA即可與DNA序列進行匹配,從而介導Cas9蛋白對DNA序列進行切割;其次,CRISPR-Cas9可編輯的位點分布頻率較高,易選擇合適的位點進行基因編輯;最重要的是,CRISPR-Cas9可同時對基因組進行多位點編輯。CRISPR/Cas9系統因其系統成分簡單、操作方便、突變效率高、成本低廉的優點,已成為現在發展最為迅速、國內外學者廣泛研究開發、應用于多種生物體基因組的定向基因編輯技術。
              CRISPR/Cas9技術主要由兩個組成部分:內切核酸酶蛋白(endonuclease)和一段引導RNAguide RNA,gRNA)。內切核酸酶是來源于化膿性鏈球菌的Cas9核酸酶蛋白。 Cas9核酸酶具有切割雙鏈DNA的兩個DNA切割結構域(RuvC1HNH樣核酸酶結構域),能夠使DNA雙鏈斷裂。gRNA是改造后的單鏈嵌合RNA,將細菌tracrRNA的支架功能與細菌crRNA的特異性相結合。gRNA 5'末端的最后20bp作為靶向序列,通過RNA-DNA堿基配對將Cas9 / gRNA復合物特異性結合至基因組DNA靶點,位于基因組DNA間隔區相鄰基序(PAM)的上游(圖1)。

      1 CRISPR/Cas9基因敲除示意圖

              不同菌株類型的CRISPR/Cas蛋白識別的PAM序列有所區別,化膿性鏈球菌Cas9的序列是5'-NGG。因此,我們所用的經過改造的CRISPR/Cas9系統,可以針對任何5'-N20-NGG DNA序列并產生精確的雙鏈斷裂。然后通過細胞生物學中通用的DNA修復機制——非同源末端連接(NHEJ)或同源定向修復(HDR),來修復雙鏈斷裂的基因組DNA(圖2)。在修復過程中會產生一定數目的堿基缺失突變或堿基插入突變,而這些插入和缺失會造成基因的外顯子閱讀框的移碼或提前引入終止密碼子,導致無法轉錄為正確mRNA,沉默gRNA結合的靶基因。

      2 CRISPR/Cas9系統沉默靶基因機制示意圖

       
      二、服務內容
      1. 設計gRNA靶向序列。
      2. 構建含有gRNACRISPR/Cas9敲除質粒,測序驗證產物。
      3. 利用構建完成的CRISPR/Cas9敲除質粒,包裝慢病毒并測定滴度。
      4. 篩選獲得的基因敲除細胞株進行T7E1驗證。
      5. 基因敲除細胞單克隆化,擴大培養后進行測序鑒定相應克隆,確認存在雙等位基因敲除。
      6. 基因敲除細胞Western檢測驗證。
       
      三、技術優勢
      1. 技術新:基于最新的CRISPR/Cas9技術,有效敲除目的基因并避免脫靶效應。
      2. 標準嚴:可以提供經過T7E1法驗證的慢病毒或細胞株,也可以提供經過Western blot驗證的多克隆細胞株。
      3. 篩選快:基于CRISPR/Cas9技術的sgRNA快速篩選和驗證體系,可以在最短的時間內完成sgRNA的篩選和T7E1法驗證。
      4. 時間短:目的基因敲除的多克隆細胞株僅需5-6周即可完成;單克隆細胞株一般在9-10周完成。
       
      四、服務提供圖片(以MSTN基因敲除為例)
      1gRNA靶向序列位置及相關參數。

      MSTN基因gRNA序列(黑體)及PAM序列(下劃線)

      2)構建完成的質粒圖譜。

      質粒構建過程

      構建完成的MSTN基因CRISPR/Cas9敲除質粒圖譜

      3)篩選細胞株T7E1驗證結果
      對敲除基因后的細胞的PCR產物進行變性和退火處理后加入T7E1 (核酸內切酶,只切割堿基錯配的DNA),經T7E1消化后可見明顯的切割條帶,說明預期的敲除位點附近存在大量gRNA引導Cas9切割形成的缺失突變。

      MSTN基因敲除細胞株T7E1驗證結果

      4)基因敲除細胞單克隆測序驗證結果。

      MSTN基因敲除細胞株單克隆測序結果。

      5)基因敲除細胞Western檢測驗證結果
              篩選獲得的陽性細胞傳代2次后,取細胞制備蛋白樣品,每孔的蛋白上樣量為20-40μg。用GAPDH作為內參,用抗MSTN的抗體檢測細胞中MSTN蛋白表達情況。

      MSTN基因敲除細胞中MSTN蛋白Western檢測結果

       
      五、服務價格及周期

      服務編號服務項目價格服務周期
      RS002-1構建CRISPR/Cas9敲除質粒,并完成測序驗證
      2
      RS002-2包裝慢病毒,并完成測定滴度驗證
      2
      RS002-3陽性細胞篩選,并完成T7E1驗證
      1
      RS002-4單克隆化陽性細胞,并完成測序驗證
      3-4
      RS002-5基因敲除細胞Western檢測驗證
      2-3
      RS002-6CRISPR/Cas9基因敲除用慢病毒(T7E1驗證)
      3-4
      RS002-7CRISPR/Cas9基因敲除用慢病毒(T7E1驗證)
      3-4
      RS002-8CRISPR/Cas9基因敲除多克隆細胞株(T7E1驗證)
      5-6
      RS002-9CRISPR/Cas9基因敲除多克隆細胞株(T7E1驗證、WB驗證)
      6-7
      RS002-10CRISPR/Cas9基因敲除單克隆細胞株(單等位基因敲除)
      9-10
      RS002-11CRISPR/Cas9基因敲除單克隆細胞株(雙等位基因敲除)
      9-10
      RS002-12敲除用慢病毒與敲除多克隆細胞株
      5-6
      RS002-13相同基因敲除用慢病毒再次訂購
      1-2
      RS002-14相同基因敲除多克隆或單克隆細胞株再次訂購
      1-2
      RS002-15相同基因敲除的不同多克隆細胞株(T7E1驗證)
      5-6
      RS002-16相同基因敲除的不同多克隆細胞株(T7E1驗證、WB驗證)
      5-6
      RS002-17相同基因敲除的不同單克隆細胞株(單等位基因敲除)
      9-10
      RS002-18相同基因敲除的不同單克隆細胞株(雙等位基因敲除)
      9-10
      RS002-19其它CRISPR/Cas9相關技術服務詢價

       

       
      六、CRISPR/Cas9技術服務流程
      1. 用戶下載并填寫CRISPR/Cas9技術服務協議書,發送至service@morecell.com.cn。
      2.  雙方確認并簽訂技術服務協議書,按照協議內容進行技術服務。
       
      七、客戶須知
      1. 客戶提供需要編輯的目的基因相關信息;
      2. 客戶提供需要編輯的細胞株及其相關信息;
      3. 客戶需要提供需要編輯目的基因的抗體(如果選做western);
      4. 敲除用慢病毒將以干冰運輸的方式提供;
      5. 基因敲除的細胞株將以干冰運輸或活細胞培養的方式提供。


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